FFPE（Formalin-fixed paraffin-embedding）样本是医学领域常见的生物材料。此类样本已经被广泛应用于高通量测序、原位杂交、*组织化学等研究领域。目前据估计，**约有数十亿FFPE组织样本保存在医院或者组织样品库中，这些组织样本是疾病诊断和科学研究的较为宝贵的的生物学资源之一。

FFPE样本
随着基因组学检测技术的快速发展，尤其新一代测序技术（NGS）的飞速发展，在细胞分子水平提供了前/所未有的检测能力，研究人员可以使用这一技术手段对FFPE样本进行研究，寻找与疾病相关的基因突变。下面让我们来详细了解一下FFPE样本从制备到检测分析相关知识点及注意事项。
FFPE样本的制备、核酸提取及分析流程如下：


Q1FFPE样本的制备
样本采集
从病人身上获得组织标本的手术涉及麻醉、血管结扎、组织的切除以及固定。从取样到组织固定这段时间内，组织中的基因表达可能发生变化，且可能发生组织自溶，因此，组织固定前的操作时间应当越短越好，以避免核酸和蛋白表达谱发生明显改变。


福尔马林固定
组织的固定使用的是福尔马林溶液。为了获得较佳的固定结果，应当使用中性的福尔马林缓冲溶液，以取代无缓冲或酸性的溶液。组织在一定浓度的福尔马林溶液中，核酸之间、蛋白质之间、以及核酸和蛋白质之间产生一定程度的交联，固定时间越长，交联程度越大。
石蜡包埋

福尔马林固定之后，需要用石蜡将组织进行包埋，此过程包含脱水、透明、浸蜡和包埋。第一步是脱水，其中水被替换成醇类，通常为乙醇。接着是透明，其中醇类被替换成二甲苯或二甲苯替代物，之后是浸蜡，其中二甲苯被置换成石蜡。最后一步是包埋，整个标本被石蜡包围。在浸蜡之前，组织标本必须完全脱水，因为残留的水分可能导致样品降解。石蜡包埋是维持蛋白完整性的关键一步，因为残留的水分可能导致蛋白水解。


在固定和包埋之后，FFPE样品较好应在较佳温度下保存，这样可减缓核酸和蛋白的降解。有研究表明FFPE样品保存在4°C，而不是室温或更高，则RNA在1年后仍基本完整。
从FFPE样品中提取出的核酸和蛋白的质量取决于固定和包埋之前、期间和之后如何处理样品，样本如果未处理好，会造成核酸严重片段化，我们需要对处理后的样本进行质控，以便后续开展核酸提取和测序等下游应用。


Q2FFPE样本核酸提取
样本切片


石蜡样本在提取前需要进行切片处理，一般需要5-6个切片，一片镜检确定**细胞含量，其他进行后续提取处理，切片的薄厚程度对后续观察和提取会有一定影响。
脱蜡和水化
因为FFPE样本的特殊性，石蜡会阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K和组织内蛋白的接触，影响到组织消化和核酸的释放。为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须组织进行彻底的脱蜡。
蛋白酶K消化
为了将DNA与结合的蛋白质分离，FFPE样本需经受高温和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶，这个步骤还可防止DNA发生降解。注意要把握好消化时间，可以根据组织类型、组织大小进行调节，使DNA充分释放。
基因组DNA纯化
FFPE样本中核酸和蛋白质是紧密交联在一起的，进行组织消化后样品已经变成水化状态，此时需要进行震荡解交联，释放DNA用于后续纯化。如果可能的话，因交联而引起的化学修饰也应当逆转，因为化学修饰的DNA不能在纯化过程中高效回收，而且在PCR或其他酶学分析中是一个不佳的底物，在断裂交联和逆转化学修饰时必须小心，因剧烈的反应条件可能导致DNA的进一步片段化。


核酸提取
根据不同的研究目的选取相应的方法提取DNA，常用的有酚氯/仿抽提法、柱膜法、磁珠法等等。




FFPE样本的DNA品质会显著影响后续荧光定量或者二代测序文库的构建成功率和测序数据指标。所以从FFPE样本中提取出高质量的DNA，是保证后续实验成功的关键。


Q3FFPE样本二代建库注意细节


DNA质控


在建库前需要先对DNA进行质检，主要检测DNA的总量（浓度）、完整性以及纯度。DNA的建库起始投入量不足、DNA有降解、存在杂质污染等这些因素会影响建库的成功率以及后续测序数据的表现。所以，浓度测定一定要准确，目的是保证建库投入量的准确性。电泳检测DNA如果有降解的话，需要根据降解程度来适当调整后续DNA的打断时间。如果存在蛋白质、RNA等杂质污染的话，需要用蛋白酶K、RNA酶等进行消化、纯化处理。目的都是为了在建库前了解DNA的质量，一方面可以提前采取措施提高建库的成功率，另一方面当后续实验或者测序数据指标出现问题时可以更好的追溯原因。


打断前损伤修复


FFPE样本在制备和保存过程中会使得基因组DNA发生一定程度的损伤，比如缺口、胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶等，为了提高文库质量，建议将DNA先用特定的酶混合物进行修复，然后再进行打断。


打断时间


FFPE样本由于保存环境以及时间的不同，提取出来的DNA会发生不同程度的降解，所以在打断的时候，打断循环数（也就是打断时间）需要根据DNA的降解程度进行调整，使打断后片段峰值尽量集中在预期的范围之内。

DNA损伤的变异数量和类型，如果忽略，可能会对较终结果产生负面影响，这对下游应用比如测序的影响是巨大的：从简单测序文库构建的失败到虚假文库的产生，较终导致结果的错误。

南京兔牙生物科技有限公司—专注于NGS测序产品链及技术服务，含有相关FFPE样本DNA提取试剂盒，欢迎大家与我司进行交流合作。

上述就是FFPE提取 FFPE样本DNA提取注意事项的相关内容，对此你还有什么不了解的，欢迎前来咨询我们网站，我们会有技术人员为你讲解

xbjgw.cn.b2b168.com/m/