FFPE样本DNA提取试剂盒能配合裂解试剂释放组织中的DNA,再通过快速磁响应结合到磁珠表面,获取高度纯化的基因组DNA。
FFPE样本DNA提取试剂盒中常用的法脱蜡法的过程和问题:
目前应用在成熟试剂盒中的脱蜡方法主要是溶剂脱蜡法,其中脱蜡法由于其脱蜡彻底的特性,较广泛的应用在疾病研究中。
在脱蜡法中,需要将石蜡包埋组织浸泡在溶液中进行脱蜡,后面经过两次高温处理,每次各一个小时,分别在56℃和90℃。在此期间结合消化缓冲液和蛋白酶K来消化组织,同时利用梯度乙醇来疏松组织结构、促进消化液渗入并去除组织中痕量。
FFPE样本DNA提取试剂盒使用中为什么要脱蜡?
如果要对FFPE组织进行分子生物学研究,开始的就是要进行DNA的提取。 但是固定剂的交联作用对核酸是有害的,福尔马林石蜡和交联作用会妨碍核酸的提取,抑制DNA聚合酶的活性从而影响PCR扩增。除此之外,石蜡阻碍消化液对组织的渗透,从而抑制蛋白酶K和组织内蛋白的接触,影响组织消化和DNA释放。所以为了消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响,必须在保证不增加外源性PCR抑制因子,并尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底脱蜡。
FFPE样本DNA提取试剂盒的应用:
福尔马林由于可以与蛋白氨基发生不可逆交联,所以对保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性方面均优于其他固定液。因此,FFPE技术长期以来在检验、科学研究中得到广泛应用,尤其是细胞形态学研究和病理学研究。随着这几年分子诊断领域的不断发展,FFPE技术也越来越多的被应用在对疾病进行分子诊断。
FFPE样本DNA提取试剂盒的常见问题分析及解决方法:
从前处理、提取、建库到测序分析,FFPE样本常见问题复杂多样,其中绝大部分问题和样本直接相关,可以通过回溯实验过程及分析来优化实验。
1、文库复杂度低
原因:样本质量差:测序深度太高;
优化方法:规范前处理、核酸提取过程;检查设备状态等;调整测序深度。
2、文库片段短
原因:样本质量差;打断时间过长
优化方法:规范前处理;调整打断时间。
3、文库总量低
原因:核酸投入/杂交投入量低;样本质量差;实验操作不规范;
优化方法:投入足够量的核酸,规范实验操作。
FFPE样本DNA提取试剂盒为福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品中的总RNA和基因组DNA的连续分离和纯化提供了一种快速方法。使用该试剂盒将RNA和DNA依次纯化成单的组分。能够纯化大部分的RNA,从大的mRNA和核糖体RNA到microRNA和小干扰RNA,取决于FFPE组织的年限,因为RNA的片段化程度将随着时间增加。在不使用或氯仿的情况下从其他细胞组分中纯化RNA。纯化的RNA具有较高的完整性,可用于许多下游应用,包括实时PCR,逆转录PCR,RNA印迹,RNA酶保护和引物延伸,以及表达谱测定。纯化的基因组DNA也具有较高质量,可用于PCR反应,测序,Southern印迹和SNP分析。
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